植物组织怎么减少污染（植物组织培养污染的概念）
植物组织培养的培养基如何抑制杂菌的污染呢？ 这就要要求你在配制培养基和材料的切取、接种时要求严格些，些许心得分享下： 培养材料及消毒 1、取材季节的影响：大多数植物应在其生长开始的季节采样, 生长末期或已进 入休眠期, 则外植体对诱导反应迟钝或无反应。 2、器官的生理状态和发育年龄：沿植物的主轴, 越向上的部分所形成的器官其 3 、生长的时间越短, 其生理年龄也越老, 越接近发育上的成熟, 越易形成花器官。反之, 越向下,其生理年龄越小。木本植物的组织培养中, 以幼龄树的春梢嫩枝段或基部的萌条较好, 下胚轴与具有3 对～4 对真叶的嫩茎段, 生长效果也较好 。一般情况下, 幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力。 3、材料大小的影响：材料越小成活率越低, 茎尖培养存活的临界大小应为一个茎尖分生组织带1 个～2 个叶原基, 约0 .2mm～0 .3mm 大小。叶片、花瓣等约为5mm2 , 茎段则长约0 .5mm。因此 , 除非用于去除病毒否则不宜将外植体切的过小。但并不是说外植体越大越好, 外植体过大易造成污染, 有实验证明外植体越大污染率越高。 4、材料的灭菌：一般是组织越大越易污染, 夏季比冬季带菌多，甚至不同年份污染的情况也有区别。取材最好选在中午或下午, 避开阴雨天取材可减少污染率。消毒是为了消灭病菌, 以保证无菌组织培养的进行。但不同植物及一株植物不同部位的组织, 其带菌程度不同, 它们对不同种类、不同浓度的消毒剂的敏感度也不一样。最初所使用的消毒剂种类, 浓度及消毒时间的长短都要进行摸索, 以达到最佳的消毒效果。 材料有绒毛最好在消毒液中加入几滴吐温- 80 ,对与难消毒的根及地下部位材料可将其浸入消毒液中进行抽气减压, 以帮助消毒液的渗入, 从而达到彻底灭菌 的目的。潘学峰等( 1998) 报道, 12% 的双氧水+ 0 .1%的升汞混合液对南方地下茎生姜灭菌10min 的效果最好。 材料的接种 1、接种室的消毒：植物组织培养技术实际上是一种无菌操作和无菌培养技术, 做好接种室的消毒是至关重要的。污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子, 因此, 每次接种前应进行地面的清洁卫生工作, 并用70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降, 并用紫外线灯照射20min。接种前超净工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗,并定期清洗过滤膜, 以延长使用寿命。 2、 无菌操作要求：工作人员使用的工作服、帽子、口罩等, 要经常保持干净, 并定期进行消毒, 即将洗净、晾干的衣帽、口罩等用纸包好后与培养基一起进行高压灭菌。工作人员的头发、衣服、手指中都带有许多杂菌, 为此要穿上工作服, 戴上帽子, 也必须剪除指甲, 并用肥皂擦洗, 最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10 min , 接种操作前则用70%酒精擦洗。工作人员的呼吸所产生的污染, 主要是 在接种时谈话或咳嗽所引起的, 因此, 在操作时应禁止谈话并应戴上口罩。 3、材料的分离、切取和接种 切割动作要快, 防止挤压使材料受损伤而招致培养失败, 也要避免使用生锈的刀片, 以防止氧化现象产生。接种时要防止交叉污染的发生,刀和镊子等接种工具使用一次应放入70% ( 或95%)酒精中浸泡, 然后灼烧放凉备用。 接种时轻轻取下封口纸, 动作要慢以免气流冲入瓶中造成污染。将瓶口靠近酒精灯火焰, 瓶口倾斜, 以免空气中的微生物落入瓶中,将瓶口外部在灯焰上燎数秒钟, 将灰尘杂物等固定在原处, 然后用镊子将外植体送入瓶中, 材料在培养容器内的分布要均匀, 以保证必要的营养面积和光照条件。茎尖、茎段等基部插入固体培养基中, 叶片通常将叶背接触培养基, 这是由于叶背气孔多, 利于吸收水分和养分的缘故。 植物组织叶绿素含量的测定如何去除杂质污染辣椒植株叶绿素含量的测定方法，取材，测定如下： 材料、仪器设备及试剂 （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。 （二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。 （三）试剂：96％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。 步骤 1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。 实验结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A665－6.88A649；Cb=24.96A649－7.32A665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量： 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。 怎样预防植物组织培养中的污染 污染原因1.1 外植体 ①年龄、种类和大小。成年植株带菌多；生理年龄老的材料带菌多；杂菌和内生菌多的外植体、有病虫害的植株，均易污染；室外生长的材料带菌多；表面有泥土的材料、地下器官均带菌多；表面积大的材料比表面积小的材料带菌多[1-2]。 ②取材时期和部位。雨季菌类繁殖旺盛，此时材料带菌多；阳光最强时紫外线较强，杀菌效果好，此时材料带菌较少；选取了不清洁、生长不旺盛部位的材料带菌多[1]。 ③灭菌效果。外植体灭菌是组织培养的关键，灭菌效果直接决定了组织培养的成败，灭菌方法和灭菌剂处理不当导致灭菌效果差，使外植体带菌。1.2 组织培养过程中各技术环节操作不规范①培养基。使用长菌的母液配制培养基；培养基pH值高、添加的有机成分均可导致细菌污染；培养基分装好后没有及时封口或封口后没有立即灭菌；培养容器口没有封严导致灭菌后细菌和真菌孢子再次进入培养容器使培养基污染；封口用的塑料盖、封口膜长时间在日光灯照射下易老化、破裂，导致密封性差，不慎使用后可能导致培养基污染；橡皮筋长时间在日光灯照射下也易松动、断裂，杂菌可能趁机进入培养容器；灭菌方法不当导致培养基污染；灭菌时间过短导致培养基灭菌不彻底；灭菌时间达到后立即打开灭菌锅，导致容器内压力差过大，使外部杂菌有可能被倒吸入容器中[1]；过滤较多溶液后，滤膜过滤效果较差，使过滤后的溶液有菌，加入培养基后造成污染。 ②培养容器和接种器具。培养容器不清洁；培养容器被污染后灭菌不彻底，再次使用时导致污染；高压灭菌锅或烘箱内培养容器、接种器具装得过满，影响灭菌效果；培养容器、接种器具灭菌时间过短导致灭菌不彻底；灭菌结束后立即打开高压灭菌锅或烘箱，强烈的冷热对流会导致冷空气被吸入包扎层内而重新造成污染带菌[1]。 ③接种人员。过长指甲；双手未清洗干净；衣服和头发有很多灰尘，接种时不换拖鞋、接种服、帽子和口罩；不慎将已污染的培养材料拿入超净工作台，转接后再次污染；培养容器中接种的培养物过多；超净工作台上物品摆放过多、过高使气流被挡住，导致灭菌效果差；接种时说话或咳嗽会呼出大量细菌；操作时手超出工作台面；手接触培养容器边缘，放在器皿、接种器械上方致使微生物落入培养容器中；打开培养容器的塞子、盖或封口膜时空气进入带来灰尘；接种过程中器械被手或带菌材料污染后未经消毒，再次使用后又污染了材料；没有在超净工作台下风方向操作而使菌类随风飘落到容器中[3]；中途离开超净工作台后马上又继续接种，将培养基、器械等物品拿入超净工作台继续接种而带入灰尘，顺风飘入器皿。服装、帽子、口罩、拖鞋长期穿戴后较脏，表面有大量灰尘，未经清洗反复穿戴后造成污染。 ④接种室和培养室。人员的进出导致接种室和培养室空气中存在大量细菌和真菌，尤其是接种过程中非工作人员的进出；接种室设计不合理，造成室内灰尘、细菌过多；超净工作台置于灰尘太多的地方，过滤装置使用过久、保养不当造成失效；组培室、接种室门窗封闭不严，苍蝇等趁机飞入，利于杂菌传播；培养室面积大易污染，室内温度高、空气湿度大，菌类繁殖旺盛也会加重污染 在组织培养实验中，有哪些措施可以降低培养物的污染物一、组织材料的无菌化； 外植体材料的预培养； 接种前表面杀菌消毒； 培养基中添加抗生素及杀菌药物。 二、器具、器材及培养基的灭菌 三、菌接种操作的技术环节保持无菌 确保接种室内清洁无菌； 确保接种人员在接种前不带菌； 接种时要保持接种台整洁； 严把接种操作无污染关； 确保接种器械在接种过程中无菌； 做好接种后清洁预消毒 四、培养室内污染的控制 以上都是基于植物组织培养的过程，动物的没做过 |